Fermentacja malolaktyczna w winie – jak zmierzyć?

Dlaczego wykonywać testy na kwas jabłkowy?

W produkcji wina, fermentacja malolaktyczna (MLF) przekształca kwas jabłkowy w kwas mlekowy oraz powoduje wydzielenie tlenku węgla CO₂ będącym produktem ubocznym reakcji. Badanie MLF przeprowadza się w większości przypadków dla wina czerwonego oraz niektórych odmian wina białego. Fermentacja malolaktyczna odgrywa ważną rolę w smaku gotowego wina. Badanie MLF zmniejsza kwasowość miareczkową, podnosi pH i wytwarza smaki często określane jako „miękkie” lub „maślane”.

Siarczyn jako SO₂ hamuje bakterie, które odpowiadają za MLF, niosąc ryzyko, że wino pozostanie niezabezpieczone przed utleniaczami i drobnoustrojami. Zaraz po zakończeniu badania MLF, SO₂ powinien zostać podniesiony do odpowiednich poziomów dla ochrony wina. Dlatego ważne jest, aby wiedzieć, kiedy MLF jest zachowana, a najlepszym sposobem na to jest pomiar poziomu kwasu jabłkowego w winie.

Teoria oznaczania

Zasada oznaczania przy użyciu zestawu Vinmetrica SC-55 opiera się na biochemicznej reakcji MLF wywołanej przez enzymy występujące w niektórych bakteriach, w tym szczepach bakterii mlekowych i bakteriach Oenococcus, a także w środku Biopressure. Bakterie te żyją w różnych składankach odżywczych, a wytwarzane CO₂ wynika niemal całkowicie z enzymatycznej przemiany kwasu jabłkowego w kwas mlekowy.    

Wyzwolone CO₂ wytwarza ciśnienie, które odczytywane jest przez miernik Vinmetrica SC-55. Ciśnienie to jest wprost proporcjonalne do ilości kwasu jabłkowego w próbce. Poziom kwasu jabłkowego można obliczyć na podstawie wartości ciśnienia przez jeden lub więcej kalibrantów kwasu jabłkowego, dostarczanych wraz z zestawem. Granica wykrywalności wynosi mniej niż 0,04 h/l. Test trwa 45 minut lub do 90 minut, jeżeli przeprowadzana jest procedura potwierdzania (szczegóły w instrukcji obsługi dołączonej do urządzenia).

Pomiar stężenia kwasu jabłkowego

Etap 1 – Przygotowanie wszystkich fiolek reakcyjnych

1. Wyjmij środek Biopressure z lodówki i pozostaw do osiągnięcia temperatury pokojowej.
2. Za pomocą dołączonej małej plastikowej miarki odmierz ok 35-40 mg (2 miarki) środka Biopressure do każdej fiolki reakcyjnej.
   a. Ze względu na konsystencję środka Biopressure zalecamy całkowite wypłukanie i wysuszenie plastikowej miarki po nałożeniu środka Biopressure po napełnieniu 5 fiolek.
3. Zakręć wszystkie fiolki reakcyjne.
4. Ułóż w rzędzie wszystkie fiolki reakcyjne potrzebne do oznaczania MLF.
5. Wszystkie pozostałe fiolki reakcyjne umieść w lodówce do momentu użycia.
6. Dokładnie spłucz plastikową miarkę wodą dejonizowaną po zakończeniu pracy.

Etap 2 – Procedura badania

Urządzenie SC-55 przeznaczone jest do odczytu stężenia w kilopaskalach (kpa) powstałego w wyniku rekcji w fiolkach reakcyjnych. Informacje te mogą zostać wykorzystane w dwóch trybach:

1. W trybie „Szybkiej kontroli” wystarczy uruchomić próbkę wina i wykorzystać wyniki z tabelą wartości w celu szybkiej oceny statusu MLF.
2. W trybie „Quantitantive” („Ilościowym”) uruchomić co najmniej jeden standard dostarczony w zestawie (0,4 g/l lub 0,1 g/l), „zero” (standard 0,00, tj. tylko bufor), a także próbkę wina (s).

Te dane mogą być wykorzystane do obliczenia ilości kwasu jabłkowego w twoim winie. Jeśli uważasz, że poziom „e” jest blisko lub blisko ukończenia MLF, sugerujemy uruchomienie trybu ilościowego przy użyciu standardu 0,1 g/l. W przeciwnym razie NIE musisz uruchamiać standardu. Więcej informacji na ten temat znajdziesz dziale „Interpretacja danych”, poniżej.

Uwaga: Poniższą procedurę sporządzono do pracy w temperaturze pokojowej (najlepiej w temperaturze 25 °C (78 °F). Temperatury poniżej 22,5 °C (73 °F) nie są zalecane, ponieważ wyniki testu mogą być mniej czułe. Należy upewnić się, że wszystkie odczynniki i fiolki reakcyjne utrzymują temperaturę pokojową przez cały czas procedury. Jeśli temperatura otoczenia jest zmienna, można wspomóc się miską z wodą w temperaturze pokojowej, aby służyła jako łaźnia wodna stabilizująca temperaturę (patrz punkt 5 poniżej). Więcej informacji na temat temperatury można znaleźć w załączniku A.

1. Wyjmij z lodówki wszystkie fiolki reakcyjne niezbędne do wykonania badania. Konieczna jest jedna fiolka reakcyjna na próbę. Jeżeli chcesz obliczyć wyniki, będziesz potrzebować co najmniej dwóch dodatkowych fiolek reakcyjnych dla odczynnika Malar Acid Standard (0,10 g/l oraz/lub 0,40 g/l (patrz punkt 9 poniżej), a także dla odpowiedniego poziomu 0,00 g/l. Pozwól, aby fiolki reakcyjne osiągnęły temperaturę pokojową. Pamiętaj, że możesz zbadać kilka próbek wina jednocześnie.
2. Wyjmij wszystkie odczynniki z lodówki i pozostaw do uzyskania temperatury pokojowej. Potrzebny będzie roztworu kwasu jabłkowego (jeżeli potrzebne będą wyniki kwantyfikacji) oraz 1-molowy Kwas jabłkowy (jeżeli uruchomiono procedurę potwierdzania, patrz poniżej). Odczynniki można umieścić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.
3. Za pomocą pipety serologicznej 10 ml odmierz taką właśnie próbkę wina i dozuj do plastikowej zlewki lub innego pojemnika o pojemności 100 ml. Pipetę serologiczną można przepłukać wodą DI do ponownego użycia. Zalecamy wyjęcie i wyrzucenie bawełnianej zatyczki umieszczonej na końcu pipety.
4. Umieść próbkę wina w kuchence mikrofalowej i gotuj przez około 60 sekund przy średniej mocy. Rzeczywisty czas zależy od mocy kuchenki mikrofalowej. Celem jest zmniejszenie próbki wina do około 7-8 ml poprzez delikatne gotowanie bez rozpryskiwania go ze zlewki. Jeżeli nie masz pewności co do mocy kuchenki mikrofalowej, zalecamy wcześniejsze eksperymentowanie z kilkoma próbkami, aby ustalić najlepsze ustawienia dostępnej kuchenki mikrofalowej. Możesz również doprowadzić wino do delikatnego wrzenia na kuchence przez około 60 sekund.
5. Pozwól, aby próbka ostygła do temperatury pokojowej, a następnie wlej próbkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj wodę destylowaną H₂0, aby przewrócić objętość do 10 ml, a następnie wlej próbkę z powrotem do 100 ml zlewki lub innej czystej probówki.
6. Wymieszaj 5 ml próbki gotowanego wina z 5 ml roztworem kwasu jabłkowego 0,00 g/l. Powtórz kroki od 3 do 6 dla każdej próbki wina. Pamiętaj, aby przepłukać pipetę pomiędzy nalewaniem standardu do kolejnych próbek wina. Przed przejściem do punktu 8 upewnij się, że wszystkie próbki osiągnęły temperaturę pokojową. Jeżeli korzystasz z łaźni wodnej, umieść odczynniki, fiolki oraz próbki wina w łaźni i pozwól ich temperaturze ustabilizować się przez co najmniej 10 minut.
7. Odłącz igłę od SC-55 odkręcając złączę Lauer Lock na spodzie urządzenia (zdjęcie 2). Odłączony zestaw do wkładania fiolki zostanie wykorzystany do wyzerowania ciśnienia natychmiast po zamknięciu próbki.
   

   Złącze Lauer Lock powinno być stabilnie przymocowane do SC-55 (Patrz punkt 10 przed wykonaniem punktu 15).

   Zdjęcie 2: Odłączanie fiolki od urządzenia SC-55.

   WAŻNE! Przed przystąpieniem do dalszego badania upewnij się, że próbka wina ma temperaturę pokojową i nie jest ciepła w dotyku!

8. Za pomocą pipety serologicznej 10 ml przenieś 3 ml próbki wina z punktu 6 do fiolki reakcyjnej ze środkiem Biopressure. Natychmiast szczelnie zamknij fiolkę, a następnie szybko ustaw ją w pozycji pionowej i nałóż na nią kolektor z igłą, tak aby igła przebiła przegrodę fiolki reakcyjnej (patrz zdjęcia 3 i 4). Należy pamiętać, że w tym przypadku SC-55 nie powinien być podłączony do kolektora. Trzymaj go w takiej pozycji przez około 3 sekundy. Natychmiast zwolnij fiolkę i energicznie wytrząsaj ją przez 5 sekund.
   
   W tym punkcie równoważone jest ciśnienie wewnętrzne w fiolce do ciśnienia otoczenia. Innymi słowy „zerowane” jest ciśnienie początkowe. Następnie potrząśniecie fiolką powoduje rozproszenie środka biopresyjnego i rozpoczęcie reakcji.
   

   Uwaga: Upewnij się, że igła NIE jest zatkana. Zobacz rozwiązywanie problemów w załączniku A.

9. Jeżeli przeprowadzany jest test ilościowy (Quantitative test), postępuj zgodnie z punktem 8 powyżej, stosując 0,4 i/lub 0,1 g/l oraz 0,0 g/l roztworu kwasu jabłkowego (w taki sam sposób, jak w przypadku próbki wina). Nie ogrzewaj standardów.
10. Powtórz punkt 8 dla każdej próbki lub roztworu kwasu jabłkowego przygotowanego do analizy. Po zakończeniu należy ponownie podłączyć kolektor z igłą do SC-55, mocno przykręcając jego złączę Lucer Lock do złącza.
11. Delikatnie, ale dokładnie wytrząsać ponownie wszystkie fiolki przez około 10 sekund.
12. Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 45 minut. Podczas tej naturalnej inkubacji wstrząśnij fiolki po upływie około 15 minut i 30 minut.
13. Włącz urządzenie SC-55. W razie potrzeby naciśnij przycisk MODE, aby wybrać kpa jako jednostkę pomiarową.
14. Po upływie 45 minut energicznie wstrząśnij fiolką przez 5 sekund, a następnie przejdź do następnego punktu. Fiolkę należy wstrząsać trzymając ją za korek, ponieważ trzymanie szklanej fiolki przenosi ciepło, co powoduje mniej dokładny odczyt ciśnienia. Nie należy zdejmować zakrętki z fiolki.
15. W tym punkcie następuje odczyt stężenia CO₂
    

    Uwaga! W tym momencie upewnij się, że wszystkie części włożone do fiolki są dobrze przymocowane.

    Ustaw fiolkę reakcyjną pionowo na powierzchni roboczej. Umieść otwór kolektora nad fiolką (zdjęcie 3). Delikatnie wepchnij go do fiolki, tak daleko, jak to możliwe i przytrzymaj go w tej pozycji (tj. aby gumowa igła w osłonie zestawu została włożona do przegrody fiolki – patrz zdjęcie 4).

    Zdjęcie 3

    Zdjęcie 4

16. Zapisz wartość, jaka pojawi się na urządzeniu zaraz po wprowadzeniu igły. Proces ten powinien zająć około 5 sekund.
17. Ponownie wyjmij fiolkę z kolektora. Jeżeli nie przeprowadzasz wielu reakcji jednocześnie, to przejdź do następnego punktu. W przeciwnym wypadku po wyjęciu fiolki, manometr powinien ustabilizować się z powrotem do początkowej wartości zerowej. Jeżeli tak się nie stało, odłącz kolektor od urządzenia i spróbuj go przedmuchać, tak aby usunąć igłę. 
18. Jeżeli nie testowałeś roztworu kwasu jabłkowego: jeśli wartość przekracza 2,0 kpa, MLF nie jest kompletny lub jeżeli MLF jest bliski lub w ukończeniu, patrz rozdział „Interpretacja danych”.
19. Jeśli testowałeś jeden lub więcej standardów kwasu jabłkowego wraz z próbką (próbkami), możesz wykonać obliczenia w trybie ilościowym (patrz rozdział „Obliczanie stężenia kwasu jabłkowego” poniżej)

a. Wynik każdej próbki wina nazwiemy oznaczeniem „a”
b. Roztwór 0,00 g/l oznaczymy jako „b”
c. Roztwór kwasu jabłkowego 0,1 g/l lub 0,40 g/l oznaczamy jako „c”
d. Postępuj zgodnie z rozdziałem „Obliczanie stężenia kwasu jabłkowego” poniżej.

Etap 3 – Procedura potwierdzająca

Aby upewnić się, że test Biopressure działa poprawnie, możesz potwierdzić dokładność wyniku testu poprzez użycie 1M koncentratu kwasu jabłkowego „ukończoną” próbką wina. W tym celu:

1. Dodaj koncentratu kwasu jabłkowego (1M):
   
   Po zarejestrowaniu odpowiedzi CO₂ w punktach 15 i 16 powyżej, otwórz fiolkę reakcyjną i dodaj 1 kroplę (30 μl) kwasu jabłkowego (1M) do próbki przy pomocy pipety z plastikową bańką. Jest to równoważność dodania 1,3 g/l kwasu jabłkowego do 3 ml próbki wina).
2. Niezwłocznie zakręć fiolkę reakcyjną i dokładnie wstrząśnij przy odłączonym zestawie do wkładania, jak opisano w punkcie 8 powyżej.
3. Pozostaw próbkę na 45 minut, a następnie powtórz kroki 13-17. Odczytaj i zanotuj ciśnienie CO₂.
4. Pod koniec procedury potwierdzania odczyt powinien wzrosnąć do ponad 4 kpa. Stanowi to potwierdzenie, że system reaguje odpowiednio przy obecności kwasu jabłkowego.

Etap 4 – Obliczanie stężenia kwasu jabłkowego (Test Ilościowy)

Jeśli przeprowadziłeś test ilościowy w trybie aktywnym, tj. standardu kwasu jabłkowego oraz próbki, możesz obliczyć także stężenie.

1. Aby obliczyć stężenie kwasu jabłkowego powinieneś posiadać trzy wartości: „a”, „b” i „c” z kroków 15-19.
   
   a – Wynik próbki wina
   b – Wynik o,00 g/l standardu kwasu jabłkowego
   c – Wynik standardu fiolki dla standardowego stężenia S (np. 0,10 g/l lub 0,40 g/l)
2. Zawartość kwasu jabłkowego (MA), w gramach na litr:
   
   MA, g/L = 2 *S *(a -b)/(c -b)
   
   Wyjaśnienie:
   
   Odejmij b od a, odejmij b od c, podziel pierwszą różnicę sekundę, a następnie pomnóż przez wynik S (stężenie twojego standardu – zwykle 0,10 lub 0,40 g/l). Wynik pomnóż przez 2 w celu uwzględnienia rozcieńczenia próbki wina przez połowę).
   Przykład dla czerwonego wina:
   a = 0,97
   b = 0,71
   c = 1,30 dla standardu 0,10 g/l (tj. S równe 0,10 ).
   
   Tak więc wzór na stężenie kwasu jabłkowego wygląda następująco:
   2x 0,10 x (0,97 – 0,71) / (1,30 – 0,71) = 0,088 g/l kwasu jabłkowego.

Po określeniu stężenia w g/l należy użyć Tabeli 1, jako przybliżonej wytycznej dotyczącej statusu MLF w Twoim winie:

Tabela 1. Stężenie i status fermentacji MLF

Podsumowanie

Więcej informacji na temat badania można przeczytać w instrukcji obsługi dołączonej do urządzenia. Vinmetrica SC-50/55 stanowi bardzo dobry sposób na pomiar fermentacji malolaktycznej w Twoim winie.  O wysokiej dokładności urządzeń firmy Vinmetrica potwierdza także porównanie przeprowadzone w ramach programu Wine Testing Lab.