Sprzęt do hodowli beztlenowej w badaniach mikrobiomu

Zmieniające się wymagania sprzętowe do hodowli beztlenowych w badaniach nad  mikrobiomem a rozwoju produktu.

Poprawa wzrostu niektórych organizmów (obecnie znanych jako bakterie) przy braku tlenu została zaobserwowana przez Louisa Pasteura w latach 60. XIX wieku. Katalityczne usuwanie tlenu z atmosfery inkubacyjnej, umożliwiające powierzchniowy wzrost bakterii na płytkach agarowych w słoju beztlenowym, zostało opracowane w latach 1910-1920, a następnie udoskonalono techniki hodowli beztlenowych, umożliwiając hodowlę najbardziej wymagających beztlenowców. W latach czterdziestych XX wieku technika Roberta Hungate’a umożliwiła hodowlę ściśle beztlenowych bakterii rozkładających celulozę ze żwacza bydlęcego w zakorkowanych probówkach – technika ta stosowana jest do dziś. W latach 60. i 70. opracowano ulepszone technologie, takie jak anaerobowe pakiety generujące gaz do zastosowania w słojach beztlenowych, a następnie pierwsze rękawicowe komory beztlenowe.

Jednak metagenomiczne analizy opracowane w XXI wieku wykazały, że większość bioróżnorodności drobnoustrojów, w tym także w ludzkim przewodzie pokarmowym, pozostała nieodkryta. Stymulowało to dalszy rozwój pożywek bakteryjnych i technik inkubacji, które przyczyniły się do rozwoju dziedziny kulturomiki: wysokoprzepustowe podejście wykorzystujące wiele równoczesnych warunków hodowli, wydłużone okresy inkubacji oraz techniki takie jak spektrometria MALDI-TOF i sekwencjonowanie genów 16S rRNA do zidentyfikowania wcześniej niehodowanych gatunków bakterii. Ponieważ duża część tych wcześniejszych „nieuprawianych” gatunków wymagała ściśle beztlenowych warunków wzrostu, konieczne stało się połączenie technik genomicznych i kulturomicznych z inkubacją beztlenową, co spowodowało konieczność zmian w konstrukcji beztlenowych komór roboczych, aby pomieścić wymagany sprzęt. 

Kiedy Don Whitley Scientific (DWS) wprowadziła w 1980 roku na rynek swoją pierwszą komorę anaerobową, była ona skierowana głównie do laboratoriów mikrobiologii klinicznej, gdzie pomogła osiągnąć lepsze wskaźniki izolacji bakterii beztlenowych z próbek pacjentów, zwiększoną przepustowość próbek i lepsze wyniki kliniczne w przypadkach infekcji beztlenowych. W tamtych czasach bakteriologia beztlenowa była nadal uważana za dość specjalistyczną i stosowała stosunkowo pracochłonne procedury. Podstawową metodą wytwarzania beztlenowej atmosfery do inkubacji był słój beztlenowy, przygotowany przy użyciu techniki próżniowo-wymiennej i najlepiej nadawał się do prac na stosunkowo małą skalę (hodowla bakterii na małej liczbie płytek agarowych). Od lat 80. do 2010 r. większość stacji roboczych beztlenowych i mikrotlenowych została zainstalowana w laboratoriach klinicznych na całym świecie, pozwalających na hodowlę takich bakterii jak Clostridium, Bacteroides i  Fusobacterium oraz mikroaerofili, jak Campylobacter i Helicobacter.

Chociaż mikrobiologia kliniczna nadal stanowi znaczący rynek dla stacji roboczych ze zmodyfikowaną atmosferą, liczba jednostek sprzedawanych do laboratoriów badawczo-rozwojowych rośnie z każdym rokiem. Sektorem rynku, w którym odnotowaliśmy największy wzrost, były badania dotyczące mikrobiomu jelitowego człowieka i jego roli w zdrowiu człowieka. Mikrobiom obejmuje nie tylko setki gatunków drobnoustrojów, ale także setki metabolitów, które bakterie zużywają i wydalają. Poprzez żywienie krzyżowe metabolity te pośredniczą w interakcjach międzygatunkowych i bezpośrednio wpływają na organizm gospodarza. Instytucje takie jak The Rowett Institute w Aberdeen, mogą teraz badać te procesy w odpowiednich warunkach fizjologicznych: stało się to możliwe dzięki najnowszej generacji większym beztlenowym stacjom roboczym, które mogą pomieścić sprzęt używany do takich badań. Powszechnym wymogiem jest obsługa automatycznego czytnika mikropłytek w warunkach beztlenowych, tak aby wpływ dostępności substratu na tempo wzrostu bakterii jelitowych można było określić jednocześnie dla wielu gatunków bakterii i/lub substratów. Inne grupy badawcze używają sortowników komórek, takich jak BioRad S3e i BD FACSMelody™. Każdy z tych instrumentów może być umieszczony w beztlenowej stacji roboczej DWS o zwiększonej wysokości i głębokości w porównaniu z modelami powszechnie stosowanymi w mikrobiologii klinicznej.

Innym ważnym obszarem badań związanych z mikrobiomem jest opracowywanie produktów terapeutycznych. W ciągu ostatniej dekady pojawiło się mnóstwo nowych terapii zawierających żywe mikroorganizmy jako substancje czynne w celu zapobiegania lub leczenia chorób u ludzi. Prototypową terapią mikrobiomową jest przeszczep mikrobioty kałowej (FMT), który jest stosowany głównie w leczeniu nawracających infekcji Clostridioides difficile (rCDI) związanych z biegunką i rzekomobłoniastym zapaleniem jelita grubego, który został po raz pierwszy odnotowany w medycynie zachodniej w latach pięćdziesiątych. W najprostszej formie, w której zhomogenizowany świeży materiał kałowy od zdrowego dawcy jest podawany pacjentowi, nie jest wymagana hodowla beztlenowa ani manipulacja produktem leczniczym; przygotowanie zawiesiny kałowej w powietrzu nie wydaje się zmniejszać jej skuteczności. FMT okazuje się również skuteczna w leczeniu innych nieswoistych chorób zapalnych jelit, a wiele grup badawczych jest zaangażowanych w zdefiniowanie kluczowych składników mikroflory kałowej odpowiedzialnych za jej działanie terapeutyczne. Takie badania napędzają przejście od słabo scharakteryzowanego konsorcjum drobnoustrojów kałowych do bardziej zdefiniowanego, stabilnego produktu, który nadaje się do długotrwałego przechowywania i zawiera racjonalnie dobrane szczepy bakteryjne w celu zwalczania określonych stanów patologicznych. W przypadku takich produktów wymagania środowiskowe wymaganych gatunków bakterii stają się ważniejsze podczas opracowywania i produkcji. Atmosfera beztlenowa jest jednym z takich wymagań i może znacząco wpłynąć na jakość produktu. W związku z tym beztlenowe stacje robocze DWS są obecnie wykorzystywane do manipulacji materiałem kałowym, konsorcjami drobnoustrojów i poszczególnymi szczepami do produkcji nowatorskich terapii. Różni się to znacznie od stosowania stanowisk roboczych do konwencjonalnej hodowli bakteryjnej tym, że ogrzewanie komory do temperatury inkubacji nie jest wymagane, a nawet może być niepożądane. 

Ponieważ produkty pochodzące z mikrobiomu doszły do ​​etapu klinicznego, określono wymagania prawne dotyczące ich rozwoju i stosowania. Główni regulatorzy leków klasyfikują te terapie jako żywe produkty bioterapeutyczne (LBP) i skodyfikowali wymagane dla nich dane dotyczące jakości, bezpieczeństwa i skuteczności. Prawie wszystkie LBP emanujące z mikroflory jelitowej zawierają bakterie ściśle beztlenowe, niektóre z nich (np. Faecalibacterium prausnitzii , Christensenella minuta) są niezwykle wrażliwe na śladowe ilości tlenu. Firma DWS dążyła do opracowania szeregu beztlenowych stacji roboczych odpowiednich do wykorzystania w rozwoju LBP w ramach obecnych ram prawnych. Rozwój LBP rozpoczyna się od wyizolowania, zbankowania i scharakteryzowania potencjalnie terapeutycznych szczepów bakteryjnych, wymagających wielu etapów hodowli i manipulacji przed otrzymaniem początkowego badawczego banku komórek (RCB). Dokumentacja jakościowa na etapie RCB musi zawierać opis pochodzenia szczepu (materiału, z którego szczep został wyizolowany) oraz historię jego hodowli/pasażowania. Niezbędne jest zapewnienie czystości kultury bakteryjnej i unikanie wprowadzania zanieczyszczeń.

Zarządzanie systemem bankowania komórek dla LBP ma kluczowe znaczenie, ponieważ zawiera substancję czynną samego produktu i może bezpośrednio wpływać na jego jakość, bezpieczeństwo i skuteczność. Po kompleksowej charakterystyce szczepu (szczepów), banki komórek macierzystych (MCB) i robocze banki komórek (WCB) muszą być przygotowane z RCB w środowisku GMP. Aby umożliwić ten proces, firma DWS opracowała szereg stacji roboczych z przepływem laminarnym, które zapewniają ściśle beztlenową atmosferę wewnętrzną w połączeniu z niektórymi funkcjami izolatora farmaceutycznego. Obecnie zaczynają być one stosowane w operacjach zgodnych z GMP, które wymagają warunków przetwarzania w warunkach beztlenowych, w tym manipulacji bankami komórek i przetwarzania materiału kałowego w celu wytworzenia standaryzowanych banków kału dawców, w postaci zamrożonego lub liofilizowanego materiału.

W DWS rozwój komór anaerobowych nadających się do użytku w środowiskach GMP był napędzany prośbami potencjalnych klientów, początkowo tych zaangażowanych w tworzenie banków dawców kału jako źródła znormalizowanego, łatwo dostępnego materiału FMT. Jednak zdobyliśmy również cenne dodatkowe informacje od mikrobiologów w naszym wewnętrznym laboratorium. W odpowiedzi na gwałtowny rozwój LBP pochodzący z mikrobioty jelitowej przeprowadzili oni serię eksperymentów w celu zbadania zmienności tolerancji tlenu wśród bakterii występujących w tym ekosystemie. W szczególności porównano wrażliwość na tlen potencjalnych patogenów, takich jak gatunki Bacteroides, Clostridium  i  Fusobacterium, z potencjalnymi szczepami terapeutycznymi, w tym Roseburia, Alistipes  i  F. prausnitzii , o których wiadomo, że są wybredne żywieniowo. Wyniki wykazały, że każdy z potencjalnie terapeutycznych szczepów był wysoce nietolerancyjny na tlen atmosferyczny, nawet przy 0,1% v/v. Podkreśliło to znaczenie ścisłych warunków beztlenowych, technik hodowli i manipulacji takimi szczepami. Wciąż otrzymujemy regularne zapytania dotyczące odpowiednich technik hodowlanych dla coraz to „nowszych” gatunków mikroflory jelitowej.

Podsumowując, zmiana zastosowań aparatury do hodowli beztlenowych, od diagnostyki klinicznej do bioterapeutyki, niesie ze sobą nowy zestaw wyzwań, oprócz utrzymywania ścisłych warunków beztlenowych. W przeszłości punktem końcowym hodowli bakterii beztlenowych było usuwanie bakterii w autoklawie. Teraz pracujemy nad podawaniem pacjentom wyhodowanych bakterii jako terapii samej w sobie. Hodowla bakterii beztlenowych przekształciła się w proces produkcji farmaceutycznej, co wymaga translacji i zwiększania skali procesów z laboratorium badawczego do zakładu produkcyjnego.

O autorze:

Dr Andrew Pridmore – kierownik działu naukowego w firmie Don Whitley Scientific Limited. Dołączył do zespołu DWS w 1991 roku jako nowy absolwent. Następnie ukończył doktorat na temat fenotypowych, metabolicznych i molekularnych odpowiedzi bakterii beztlenowych na ekspozycję tlenową, koncentrując się na bakteriach związanych z chorobami przyzębia. Obecnie zarządza naszym firmowym laboratorium mikrobiologicznym, w którym na co dzień pracujemy z „wybrednymi” beztlenowcami. Głównym obszarem pracy jest testowanie wrażliwości na antybiotyki beztlenowców na zlecenie naszych klientów zajmujących się badaniami kontraktowymi. W ostatnich latach Andrew nadzorował również prace nad hodowlą, liczeniem i badaniem wrażliwości wysoce wybrednych szczepów beztlenowców z normalnej ludzkiej mikroflory, które są opracowywane jako żywe produkty bioterapeutyczne.

Przekład artykułu: Anaerobic Culture Equipment in Microbiome Research, dwscientific.com